Tweet
POLIMERAZ ZINCIR REAKSIYONU (PCR)
Ilk kez 1985'de bilim dünyasına sunulduğundan itibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hem araştırmada hem de klinik laboratuvarlarda tanıda yeni bir çığır açmıştır.ABD'de Cetus Corporation'da çalışan Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafından geliştirilmiştir. Metod basitçe tüpte nükleik asitlerin uygun koşullarda çoğaltılmasıdır.(Science,1985:230,1350). Bu bulusundan dolayı K.Mullis, 1993 yılı Nobel Kimya Ödülüne hak kazanmıştır.
PCR, bir çeşit "in vitro klonlama"dir. PCR, reaksiyonu DNA'nin iki zincirinin yüksek isi ile birbirinden ayrılmasını (denatürasyon); daha sonra sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya bağlanmasını(hibridizasyonu); sonra zincirin uzamasını (polimerizasyonu) (çift iplikçikli DNA'larin sentezi) ve bu sikluslarin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır. Bu üç adim (denatürasyon / primer bağlanması / DNA sentezi) bir PCR siklusunu oluşturur. Her adim farklı ısılarda gerçekleştirilir. (Sırasıyla 94°C-98°C; 37°C-65°C; 72°C ). PCR tekniği tek veya çift iplikçikli DNA’yı; RNA'ya hedef olarak kullanabilir. Bu teknikle; bir DNA hedefini 106-1012 arasında çoğaltmak mümkündür.Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz uzunluğunda) kullanılarak; bu iki primer ile sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır.
PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamaktadır. PCR tekniği ile laboratuvar tanısında çok büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; bir çok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale gelmiştir. PCR Teknolojisi için:
1) DNA örneği, genelde genomik DNA,
2) Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer,
3) dNTP'ler (A,T,C,G),
4) Isıya dayanıklı DNA-Polimeraz enzimi,
5) Uygun pH ve iyon koşullarını (Mg+2) sağlayan tampon karışımı gereklidir.
PCR'nin orijinal protokolünde E.Coli DNA polimerase I'in Klenow Fragment'i birlesen oligonükleotidlerin polimerizasyonunda kullanılmıştır. Ancak DNA'yi denatüre etmek için gerekli olan ısıya ulaşıldığında; enzim inaktive olur. Her ne kadar bu yöntem 200 bp altındaki reaksiyonlar için iyi çalışmışsa da; uzun segmentlerde yürümemiştir. PCR ürünü çok iyi olmayıp; mispriming (primerin yanlış bölgeye yapışması) olayına bağlı olarak-farklı büyüklüklerde PCR ürünü elde edilmiştir. Bu tip problemler ısıya dayanıklı Taq Polimerazlarin bulunması ile önlenmiştir.
ILK BIRKAÇ SIKLUS
Ilk birkaç siklus, spesifik DNA parçalarının hedef DNA'da yapışabilecekleri yerleri tarama fazıdır. Amplifikasyon daha sonra baslar. PCR'in tüm sikluslari, bir önceki siklusda sentezlenen örneklerin denatürasyonu ile baslar. Ilk birkaç siklusun optimizasyonu, çok az miktarda DNA örneği ile yola çıkılan durumlarda (tek hücre veya parafin bloklardaki doku); tarama olayı aşırı miktarda sarf malzemesine karşın az DNA'ya karşı oluşmaktadır. Az DNA'nin bulunması PCR'ın tarama fazında primer ile DNA'nin birbirleri ile karsılaşma şanslarını azaltır. Öyle ki primer-primer karsılaşmaları daha fazla olur. Bu ise primer dimerlerini ve diger artefaklarin oluşmasına yol açar. Bu problemi ortadan kaldırmak için Booster PCR kullanılmıştır. Ilk bir kaç siklusda primer dilüe edilerek reaksiona konur, daha sonraki sikluslarda ise primer miktarı arttırılarak reaksiyona eklenir.
PCR KULLANIM ALANLARI
PCR'in baslıca kullanım alanları su şekilde sıralanabilir:
1. Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı,
2. Prenatal tanıda,
3. Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması,
4. Adli tıpta,
5. Onkogenesisin araştırılmasında,
6. Probe'larin oluşturulmasında/klonlamada/gen expresyon araştırmalarında,
7. DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında,
8. Bilinmeyen dizilerin tayininde,
9. Geçmiş DNA'nin incelenmesi ve evrimin aydınlanmasında,
10. Restriksiyon Fragment Length Polimorfizm Analizinde,
11. Invitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılması ve sonra implantasyon gerçekleştirilmesi ile bebeğin normal dogmasının sağlanması,
12. DNA protein interaksiyonunun araştırılmasında (footprinting) kullanılabilir.
MUTASYONLARIN ANALIZINDE PCR
PCR tekniğinden yola çıkılarak geliştirilmiş teknikler, mutasyon analizinde kullanılır hale gelmiştir. Başlıcaları şunlardır:
1. Direk Restriction Endonükleaz kullanılarak
2. Allele-spesifik Oligonükleotidler'in kullanımı (ASO): Hibridizasyonda iki oligonükleotid kullanılır. Amplifiye edilmiş DNA, bir naylon membran üzerine konduktan sonra ayrı ayrı bu oligonükleotidler (radyoaktif veya nonradyoaktif) ile hibridize edilir. Bu oligonükleotidlerin dizileri birbirlerinden mutasyona uygun tek nükleotid değişikliği ile ayrılırlar (Sekil 7.16).
3. ARMS Tekniği veya PASA Tekniği
4. Reverse Dot-Blot Yöntemi. Mutasyona uyan oligonükleotidler ve normal DNA dizisine uyan oligonükleotidler (toplumdaki siklik önemlidir) nitrosellüloz/naylon membrana konurlar. Amlifiye edilen DNA işaretlenerek-hibridizasyona sokulur.
5. PCR-SSCP Teknigi.
6. Single spesifik Primer-PCR (SSC-PCR),
7. Delesyon analizinde PCR
8. Multipleks PCR
9. Inverse PCR
10. RNA PCR
11. Denatüring gradient gel elektroforezi
12. Füzyon genlerin analizi
13. Kromozomal translokasyonlarin analizi
14. DNA dizi analizi
15. Diğer PCR'a dayalı teknikleri
.
PCR INHIBISYONU
PCR, bazı nedenlerle inhibe edilebilir. Bunlar söyle sıralanabilir:
1. Ortamda RNA düzeyinin yüksek olması. (Ortama eğer, RNase eklenirse, elde edilecek PCR ürün miktarı artış gösterir.
2. EDTA'nin yüksek konsantrasyonda olması, PCR'i Mg'u bağlaması nedeni ile inhibe eder.
3. Heparinin ortamda bulunması, PCR'i inhibe eder.
4. Ortamda fenol kalıntısının bulunması PCR'i inhibe eder.
5. DMSO'nun ortamda %10 konsantrasyonda olmasıyla, PCR %50 oranında inhibe olur.
6. Urasil konsantrasyonunun yüksek olması
7. Uzun süre UV ışığa maruz kalan "mineral oil", PCR'i inhibe eder.
8. PCR komponentlerinin konulduğu tüplerin yapisi da PCR etkinliğini etkiler.
9. Upstream nokta mutasyonları ile DNA'da kompresyon oluşabilir, bu da PCR oluşumunu engelleyebilir. Bu özellikle, mikro delesyon ve/veya insertionlarin olduğu durumlarda ortaya çıkabilir.
Ilk kez 1985'de bilim dünyasına sunulduğundan itibaren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR); hem araştırmada hem de klinik laboratuvarlarda tanıda yeni bir çığır açmıştır.ABD'de Cetus Corporation'da çalışan Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafından geliştirilmiştir. Metod basitçe tüpte nükleik asitlerin uygun koşullarda çoğaltılmasıdır.(Science,1985:230,1350). Bu bulusundan dolayı K.Mullis, 1993 yılı Nobel Kimya Ödülüne hak kazanmıştır.
PCR, bir çeşit "in vitro klonlama"dir. PCR, reaksiyonu DNA'nin iki zincirinin yüksek isi ile birbirinden ayrılmasını (denatürasyon); daha sonra sentetik oligonükleotidlerin hedef DNA'ya bağlanmasını(hibridizasyonu); sonra zincirin uzamasını (polimerizasyonu) (çift iplikçikli DNA'larin sentezi) ve bu sikluslarin belirli sayıda tekrarlanmasına dayanır. Bu üç adim (denatürasyon / primer bağlanması / DNA sentezi) bir PCR siklusunu oluşturur. Her adim farklı ısılarda gerçekleştirilir. (Sırasıyla 94°C-98°C; 37°C-65°C; 72°C ). PCR tekniği tek veya çift iplikçikli DNA’yı; RNA'ya hedef olarak kullanabilir. Bu teknikle; bir DNA hedefini 106-1012 arasında çoğaltmak mümkündür.Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz uzunluğunda) kullanılarak; bu iki primer ile sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır.
PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamaktadır. PCR tekniği ile laboratuvar tanısında çok büyük bir hız ve kesinlik kazanılmış; bir çok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale gelmiştir. PCR Teknolojisi için:
1) DNA örneği, genelde genomik DNA,
2) Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer,
3) dNTP'ler (A,T,C,G),
4) Isıya dayanıklı DNA-Polimeraz enzimi,
5) Uygun pH ve iyon koşullarını (Mg+2) sağlayan tampon karışımı gereklidir.
PCR'nin orijinal protokolünde E.Coli DNA polimerase I'in Klenow Fragment'i birlesen oligonükleotidlerin polimerizasyonunda kullanılmıştır. Ancak DNA'yi denatüre etmek için gerekli olan ısıya ulaşıldığında; enzim inaktive olur. Her ne kadar bu yöntem 200 bp altındaki reaksiyonlar için iyi çalışmışsa da; uzun segmentlerde yürümemiştir. PCR ürünü çok iyi olmayıp; mispriming (primerin yanlış bölgeye yapışması) olayına bağlı olarak-farklı büyüklüklerde PCR ürünü elde edilmiştir. Bu tip problemler ısıya dayanıklı Taq Polimerazlarin bulunması ile önlenmiştir.
ILK BIRKAÇ SIKLUS
Ilk birkaç siklus, spesifik DNA parçalarının hedef DNA'da yapışabilecekleri yerleri tarama fazıdır. Amplifikasyon daha sonra baslar. PCR'in tüm sikluslari, bir önceki siklusda sentezlenen örneklerin denatürasyonu ile baslar. Ilk birkaç siklusun optimizasyonu, çok az miktarda DNA örneği ile yola çıkılan durumlarda (tek hücre veya parafin bloklardaki doku); tarama olayı aşırı miktarda sarf malzemesine karşın az DNA'ya karşı oluşmaktadır. Az DNA'nin bulunması PCR'ın tarama fazında primer ile DNA'nin birbirleri ile karsılaşma şanslarını azaltır. Öyle ki primer-primer karsılaşmaları daha fazla olur. Bu ise primer dimerlerini ve diger artefaklarin oluşmasına yol açar. Bu problemi ortadan kaldırmak için Booster PCR kullanılmıştır. Ilk bir kaç siklusda primer dilüe edilerek reaksiona konur, daha sonraki sikluslarda ise primer miktarı arttırılarak reaksiyona eklenir.
PCR KULLANIM ALANLARI
PCR'in baslıca kullanım alanları su şekilde sıralanabilir:
1. Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı,
2. Prenatal tanıda,
3. Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması,
4. Adli tıpta,
5. Onkogenesisin araştırılmasında,
6. Probe'larin oluşturulmasında/klonlamada/gen expresyon araştırmalarında,
7. DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında,
8. Bilinmeyen dizilerin tayininde,
9. Geçmiş DNA'nin incelenmesi ve evrimin aydınlanmasında,
10. Restriksiyon Fragment Length Polimorfizm Analizinde,
11. Invitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılması ve sonra implantasyon gerçekleştirilmesi ile bebeğin normal dogmasının sağlanması,
12. DNA protein interaksiyonunun araştırılmasında (footprinting) kullanılabilir.
MUTASYONLARIN ANALIZINDE PCR
PCR tekniğinden yola çıkılarak geliştirilmiş teknikler, mutasyon analizinde kullanılır hale gelmiştir. Başlıcaları şunlardır:
1. Direk Restriction Endonükleaz kullanılarak
2. Allele-spesifik Oligonükleotidler'in kullanımı (ASO): Hibridizasyonda iki oligonükleotid kullanılır. Amplifiye edilmiş DNA, bir naylon membran üzerine konduktan sonra ayrı ayrı bu oligonükleotidler (radyoaktif veya nonradyoaktif) ile hibridize edilir. Bu oligonükleotidlerin dizileri birbirlerinden mutasyona uygun tek nükleotid değişikliği ile ayrılırlar (Sekil 7.16).
3. ARMS Tekniği veya PASA Tekniği
4. Reverse Dot-Blot Yöntemi. Mutasyona uyan oligonükleotidler ve normal DNA dizisine uyan oligonükleotidler (toplumdaki siklik önemlidir) nitrosellüloz/naylon membrana konurlar. Amlifiye edilen DNA işaretlenerek-hibridizasyona sokulur.
5. PCR-SSCP Teknigi.
6. Single spesifik Primer-PCR (SSC-PCR),
7. Delesyon analizinde PCR
8. Multipleks PCR
9. Inverse PCR
10. RNA PCR
11. Denatüring gradient gel elektroforezi
12. Füzyon genlerin analizi
13. Kromozomal translokasyonlarin analizi
14. DNA dizi analizi
15. Diğer PCR'a dayalı teknikleri
.
PCR INHIBISYONU
PCR, bazı nedenlerle inhibe edilebilir. Bunlar söyle sıralanabilir:
1. Ortamda RNA düzeyinin yüksek olması. (Ortama eğer, RNase eklenirse, elde edilecek PCR ürün miktarı artış gösterir.
2. EDTA'nin yüksek konsantrasyonda olması, PCR'i Mg'u bağlaması nedeni ile inhibe eder.
3. Heparinin ortamda bulunması, PCR'i inhibe eder.
4. Ortamda fenol kalıntısının bulunması PCR'i inhibe eder.
5. DMSO'nun ortamda %10 konsantrasyonda olmasıyla, PCR %50 oranında inhibe olur.
6. Urasil konsantrasyonunun yüksek olması
7. Uzun süre UV ışığa maruz kalan "mineral oil", PCR'i inhibe eder.
8. PCR komponentlerinin konulduğu tüplerin yapisi da PCR etkinliğini etkiler.
9. Upstream nokta mutasyonları ile DNA'da kompresyon oluşabilir, bu da PCR oluşumunu engelleyebilir. Bu özellikle, mikro delesyon ve/veya insertionlarin olduğu durumlarda ortaya çıkabilir.